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小鼠骨髓染红细胞微核的测定方法

实验原理

染色单体或染色体的无着丝点断片,或因纺锤体受损而丢失的整个染色体,在细胞分裂后期,仍然遗留在细胞质中。末期之后,单独形成一个或几个规则的次核,被包含在子细胞的胞质内,因比主核小,故称为微核。大小应为主核的1/20~1/5。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样。微核率是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关,所以可用简易的、快速、灵敏的微核计数来代替繁杂的畸变染色体计数。Matter 和Schmid建立的微核测试是一种比较理想的方法,目前国内外已把微核测试用于辐射损伤、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。

实验对象

成年健康小鼠,体重25g左右,雌雄均可。

实验试剂与器材

(1)器材:显微镜、低速离心机、电子天平、解剖器械(搪瓷解剖盘、探针、剪刀、镊子)、注射器、试管、试管架、磨口试剂瓶、滴管、染色缸、洗耳球、量筒、清洁载玻片。

(2)试剂:0。9%生理盐水、灭活的小牛血清、环磷酰胺、甲醇、PBS (pH6。8)、Giemsa染液、瑞氏染液。

实验方法与步骤

(1)环磷酰胺处理:取骨髓前24h先给小鼠腹腔注入环磷酰胺,注射剂量为100mg/kg动物体重。

(2)取骨髓:用损伤脊髓法处死小鼠,然后用剪刀剪开大腿上的皮肤和肌肉,取出大腿骨,用一小块纱布来回搓干净附在骨上的肌肉碎渣。剪掉股骨两端膨大的关节头,然后用注射器吸取5ml生理盐水,插入股骨一端,将骨髓细胞冲洗至10ml的离心管中。可重复冲洗多次,直至骨髓腔呈白色为止。

(3)离心处理:将所获得的细胞悬浮液以1000rpm离心10min,吸去上清液,在沉淀物中加入2滴灭活的小牛血清,制成细胞悬液。

(4)涂片:滴一滴悬液于载玻片一端,按常规方法涂片,在空气中晾干。

(5)固定:将晾干的载玻片放入甲醇固定液中10min,取出晾干。

(6)染色:将制片平放在玻璃板上,用1∶9∶10的Giemsa∶PBS∶瑞氏染液,染色15min,流水冲洗后晾干即可镜检。

(7)观察:嗜多染红细胞为年幼红细胞,呈灰蓝色,略大于红细胞(红色),微核多呈圆形和椭圆形,呈蓝紫色或紫红色(图13-3)。

(8)结果分析:在显微镜下,每只小鼠骨髓涂片标本计数1000~2000个嗜多染红细胞,包括其中出现微核的细胞数,将结果填入表内,并计算微核细胞率,观察记录结果(表13-2)。按100mg/kg体重剂量给小鼠腹腔注射环磷酰胺,其嗜多染红细胞微核率为(48.9±3.6)%。正常小鼠嗜多染红细胞微核率为5‰以下,超过5‰为异常。

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